BeYaMATM 1干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)：
一、 培養(yǎng)皿包被
1、 4℃溶解Matrigel（BD 354277）過(guò)夜，輕搖混勻。請(qǐng)注意：原液應(yīng)是均質(zhì)粘稠的半流體狀態(tài)，要避免溫度過(guò)高，否則Matrigel會(huì)變成凝膠狀態(tài)。
2、 冰上預(yù)冷1.5ml離心管和移液器槍頭，冰上快速將Matrigel分裝成350-500ul/支，儲(chǔ)存于-80℃，用前置于4℃解凍。
3、 將溶解的Matrigel加入25ml預(yù)冷的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
4、 將稀釋的Matrigel加入六孔板中，1ml/孔，輕搖培養(yǎng)板，使Matrigel均勻鋪在培養(yǎng)板底部。
5、 Parafilm封好包被的培養(yǎng)板，置于4℃儲(chǔ)存，用前置于37℃培養(yǎng)箱中孵育至少1小時(shí)。
二、 培養(yǎng)液準(zhǔn)備
1、 在4℃解凍BeYaMATM 15X Supplement（貨號(hào)：HJ0103M）添加劑，加入BeYaMATM 1Basal Medium（貨號(hào)：HJ0102M）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，形成500mL BeYaMATM 1 Complete Medium（貨號(hào)：HJ0101M）完全培養(yǎng)基。
2、 BeYaMATM 1完全培養(yǎng)基可在4℃穩(wěn)定儲(chǔ)存2周。可按實(shí)際用量將BeYaMATM 1完全培養(yǎng)基分裝后置于-80或-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
三、 hESCs/hiPSCs復(fù)蘇
1、 復(fù)蘇hESCs/hiPSCs前，復(fù)溫Matrigel包被的培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)液體，加入2ml BeYaMATM 1完全培養(yǎng)液及2ul 5uM/L Rock Inhibitor Y27632，用以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。
2、 從液氮罐中取出hESCs/hiPSCs凍存管，浸入37℃水浴，輕輕搖晃，直到細(xì)胞融化至僅剩一小塊冰晶，迅速取出并用75%酒精擦拭凍存管外表面，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌超凈臺(tái)中。
3、 將細(xì)胞懸液接種至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分布在板底。
4、 小心將培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中，避免振動(dòng)。
5、 30-90min后顯微鏡下觀察細(xì)胞基本貼壁，更換新鮮BeYaMATM 1完全培養(yǎng)液，之后每24h換液，4-6天后傳代。
四、 hESCs/hiPSCs傳代
1、 提前準(zhǔn)備好Matrigel（BD 354277）包被過(guò)的六孔板，吸棄孔內(nèi)包被液，加入2ml BeYaMATM 1完全培養(yǎng)液。
2、 吸棄待傳代hESCs/hiPSCs孔內(nèi)的培養(yǎng)液，并用1ml無(wú)鈣鎂的PBS洗1遍。
3、 加入0.5ml Accutase細(xì)胞分離液使之完全覆蓋皿底。
4、 室溫孵育5-8分鐘或37℃孵育3-5分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，細(xì)胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時(shí)，可吸去Accutase。
5、 可將培養(yǎng)板放置37℃繼續(xù)孵育1min,或者直接加入適量新鮮BeYaMATM 1完全培養(yǎng)液，輕輕搖晃，干細(xì)胞集落基本脫落。亦可用細(xì)胞刮刀將剩余克隆輕輕刮下，盡量避免用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞。
6、 將制備好的細(xì)胞懸液按1：3 – 1：6的比例接種至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中，注意細(xì)胞過(guò)密則克隆邊界不圓滑，易分化，細(xì)胞過(guò)稀則克隆存活率降低。
7、 輕輕搖晃培養(yǎng)板讓細(xì)胞均勻分散，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
8、 每天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，或者克隆中央密度過(guò)大，影響細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行傳代。
如果您在使用BeYaMATM 1Human iPSC/ESC Growth Medium 人多能干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的過(guò)程中，有任何技術(shù)問(wèn)題，我們開(kāi)通了Juvi科學(xué)家技術(shù)團(tuán)隊(duì)郵箱，歡迎您發(fā)郵件到[email protected] 進(jìn)行交流溝通，我們的目標(biāo)是：推動(dòng)中國(guó)iPS干細(xì)胞技術(shù)走向產(chǎn)業(yè)和臨床！
