UID轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)試劑盒

• 省時(shí)??同時(shí)構(gòu)建8個(gè)文庫(kù)僅5小時(shí)，時(shí)間節(jié)省30％
• 省力??無(wú)需第二鏈合成等步聚，操作簡(jiǎn)便
• 省心??建庫(kù)起始量低至100ng
• 精確??測(cè)序結(jié)果與qPCR結(jié)果高度一致

? ? ? 轉(zhuǎn)錄組為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有 RNA，主要包括mRNA，某些情況下也包括非編碼 RNA。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序利用高通量測(cè)序技術(shù)，快速且全面地揭示某一物種特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息，包括轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量、可變剪接體、可變 polyA 位點(diǎn)等。

? ??? 絕對(duì)定量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（KC-DigitalRNA-seq），在文庫(kù)擴(kuò)增之前為每一條 RNA 片段加上特有的身份標(biāo)簽（Unique Identifier，UID）。那么同一個(gè)片段擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物均帶有相同的標(biāo)簽，而天然重復(fù)片段則帶有不同的標(biāo)簽。測(cè)序完成后利用 UID 過(guò)濾數(shù)據(jù)，將相同標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行合并，就能準(zhǔn)確去除 PCR 擴(kuò)增重復(fù)、同時(shí)保留樣本的天然重復(fù)，一比一準(zhǔn)確還原樣本擴(kuò)增前的原始狀態(tài)。在此過(guò)程中，PCR 擴(kuò)增和測(cè)序錯(cuò)誤同樣可以被糾正：擴(kuò)增和測(cè)序的錯(cuò)誤會(huì)使得相同 UID 標(biāo)簽對(duì)應(yīng)多個(gè)不同的序列，那么只需比較這些序列的相似性，即可糾正這些錯(cuò)誤。

測(cè)序結(jié)果對(duì)比

??KC-DigitalRNA 建庫(kù)方法 VS 基于 dUTP 鏈特異性的 RNA 建庫(kù)方法

? ? ?KC-DigitalRNA 建庫(kù)方法采用獨(dú)特的 splint ligation（單鏈加接頭）方法，省去了 cDNA 第二鏈的合成、修復(fù)和加 A 的步驟，建庫(kù)總時(shí)長(zhǎng)縮短 1~2 小時(shí)。

測(cè)序數(shù)據(jù)分析

? ? ? raw data 進(jìn)行質(zhì)量控制后，測(cè)序數(shù)據(jù)（clean data）重復(fù)序列水平結(jié)果如下圖所示：

? ? ? ??不計(jì)算 UID 特有識(shí)別序列時(shí)，重復(fù)次數(shù)為 1 的 reads（unique reads）的比例約為 18%，計(jì)算 UID 特有識(shí)別序列時(shí)，unique reads 的比例提高到約 28%。在總 reads 中，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生的重復(fù) reads 約占 10%。通過(guò)對(duì)多個(gè)樣本的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在總 reads 中 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生的重復(fù) reads 約占 8%~11%。

KC-DigitalRNA 測(cè)序結(jié)果 VS 常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

（1）常規(guī)轉(zhuǎn)錄組和 KC-DigitalRNA 測(cè)序篩選差異表達(dá)基因的結(jié)果

clean_up:常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選獲得的差異上調(diào)基因
UID_filter_up: KC-DigitalRNA 測(cè)序 UID 過(guò)濾后篩選獲得的差異上調(diào)基因
clean_down:常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選的差異下調(diào)基因
UID_filter_ down: KC-DigitalRNA 測(cè)序 UID 過(guò)濾后篩選獲得的差異下調(diào)基因

（2）常規(guī)轉(zhuǎn)錄組和 KC-DigitalRNA 測(cè)序結(jié)果通過(guò) qPCR 驗(yàn)證

? ? ?常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與 qPCR 定量結(jié)果的相關(guān)系數(shù) R2 為 0.859，KC-DigitalRNA 測(cè)序與 qPCR 定量結(jié)果的相關(guān)系數(shù) R2 達(dá)到 0.985。

KC-DigitalRNA 建庫(kù)方法不同起始量建庫(kù)測(cè)序結(jié)果

? ? 分別使用 100ng、500ng、1ug 作為建庫(kù)起始量，并將不同建庫(kù)起始量的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析相，皮爾遜相關(guān)系數(shù)關(guān)系數(shù) R2均在 0.97 以上。

A：unique reads比例提升。不計(jì)算UID標(biāo)簽序列時(shí)，重復(fù)次數(shù)為1的reads（unique reads）的比例約為18%，計(jì)算UID標(biāo)簽序列時(shí)，unique reads的比例提高到約28%。多個(gè)樣本統(tǒng)計(jì)顯示，在總reads中PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的重復(fù)約占8％－11％
B：與qPCR結(jié)果高度一致，分別用UID轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)測(cè)序和qPCR檢測(cè)表達(dá)倍數(shù)變化，兩種方法的結(jié)果相關(guān)性達(dá)到0.985

C：不同建庫(kù)起始量相關(guān)性高。分別使用1ug、500ng、100ng起始量進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序，不同起始量的結(jié)果皮爾遜相關(guān)系數(shù)R²均超過(guò)0.978

轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)試劑盒產(chǎn)品信息

? ????貨號(hào)? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?名稱? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?規(guī)格

DRO85－01? ?? ? ?KC-Digital^TM?Stranded?mRNA-seq?Library?Prep?Kit??for Illumina^{?? ? ? ? ? ? ? ? ?24 rxn}

DRO85－02? ? ? ? KC-Digital^TM?Stranded?mRNA-seq?Library?Prep?Kit??for Illumina^{?? ? ? ? ? ? ? ? ?96?rxn??}

DLRO87－01? ? ? ?KC-Digital^TM?Total?RNA-seq?Library?Prep?Kit?for?Illumina^{?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 24rxn??}

DLRO87－02? ? ? ?KC-Digital^TM?Total?RNA-seq?Library?Prep?Kit?for?Illumina^{?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??96?rxn?}